Diedit oleh Peter Sarnow, Fakultas Kedokteran Universitas Stanford, Universitas Stanford, California, disetujui pada 25 Desember 2020 (ditinjau pada 25 Oktober 2020)
Kami melaporkan interaksi antar subunit dalam replikasi kompleks transkripsi virus corona, yang penting untuk replikasi dan konservasi evolusi.Kami memberikan bukti bahwa domain NiRAN yang terkait dengan nsp12 memiliki aktivitas transferase nukleosida monofosfat (NMP) dalam trans, dan mengidentifikasi nsp9 (protein pengikat RNA) sebagai targetnya.NiRAN mengkatalisis perlekatan kovalen bagian NMP ke ujung amino nsp9 yang dilestarikan dalam reaksi yang bergantung pada ion Mn2+ dan residu Asn yang dilestarikan di dekatnya.Ditemukan bahwa aktivitas NiRAN dan nsp9 NMPylation sangat penting untuk replikasi virus corona.Data tersebut memungkinkan kita untuk menghubungkan aktivitas penanda enzim virus bersarang ini dengan pengamatan sebelumnya dalam hipotesis bahwa inisiasi sintesis RNA dalam kelas virus RNA konsisten secara fungsional dan evolusioner.
RNA polimerase (RdRps) yang bergantung pada RNA dari Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, dan 12 famili lainnya) dihubungkan dengan domain amino-terminal (N-terminal) dalam protein non-struktural (nsp) yang dilepaskan dari poliprotein, yang disebut NiRAN 1ab terdiri dari protease utama virus (Mpro).Sebelumnya, aktivitas GMPylation/UMPylation dari virus arteri NiRAN-RdRp nsp telah dilaporkan, dan disarankan untuk menghasilkan transien untuk transfer nukleosida monofosfat (NMP) ke virus (yang saat ini tidak diketahui) dan/atau biopolimerisasi sel.Di sini, kami menunjukkan bahwa virus corona (Human Coronavirus [HCoV]-229E dan Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) memiliki aktivitas NMPylation yang bergantung pada Mn2+, yang berasal dari nsp9 melalui pembentukan nsp9 yang dimediasi Mpro. nsps yang mengapit terminal-N dilepaskan secara proteolitik, fosforamidat terikat pada amina primer (N3825) di terminal-N nsp9.Uridine trifosfat adalah nukleotida yang disukai dalam reaksi ini, tetapi adenosin trifosfat, guanosin trifosfat, dan sitidin trifosfat juga merupakan substrat tambahan yang cocok.Studi mutasi menggunakan protein rekombinan virus corona nsp9 dan nsp12 serta mutan HCoV-229E yang direkayasa secara genetik menentukan residu yang diperlukan untuk NMPylation nsp9 yang dimediasi NiRAN dan replikasi virus dalam kultur sel.Data tersebut mengkonfirmasi prediksi residu situs aktif NiRAN dan menentukan peran penting residu nsp9 N3826 dalam nsp9 NMPylation dan replikasi virus in vitro.Residu ini adalah bagian dari rangkaian tripeptida NNE terminal-N yang dilestarikan dan terbukti menjadi satu-satunya residu invarian nsp9 dan homolognya dalam keluarga virus corona.Studi ini memberikan dasar yang kuat untuk studi fungsional aktivitas NMPylation dari virus lain yang bersarang dan mengusulkan kemungkinan target untuk pengembangan obat antivirus.
Virus RNA untai positif Nidovirales menginfeksi berbagai vertebrata dan invertebrata (1, 2).Urutan tersebut saat ini mencakup 14 keluarga (3), yang mana keluarga virus Corona telah dipelajari secara ekstensif dalam 20 tahun terakhir.Pada saat itu, tiga virus corona zoonosis muncul dari inang hewan dan menyebabkan wabah infeksi saluran pernafasan parah dalam skala besar pada manusia.Termasuk pandemi persisten yang disebabkan oleh penyakit menular akut yang parah.Sindrom Pernapasan Virus Corona 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirus berbagi organisasi genom yang sama, dan subunit kompleks transkripsi-replikasi (RTC) yang terikat membran dikodekan dalam dua pertiga terminal 5-?² dan subunit struktural utama partikel virus, serta beberapa aksesori. .Protein, dikodekan pada sepertiga ujung genom (1).Kecuali satu keluarga virus planaria (Monoviridae) (8), semua virus bersarang mengkodekan subunit RTC dalam dua bingkai pembacaan terbuka besar (ORF) ORF1a dan ORF1b, yang diterjemahkan dari RNA genom.ORF1a mengkodekan poliprotein (pp) 1a, dan ORF1a dan ORF1b bersama-sama mengkodekan pp1ab.Dengan partisipasi umum dari protease utama (Mpro) yang dikodekan oleh ORF1a, baik pp1a dan pp1ab diproses secara proteolitik menjadi berbagai protein non-struktural (nsps), juga dikenal sebagai 3CLpro, karena memiliki homologi dengan 3Cpro dari picornavirus ( 9).Nsps ini diperkirakan dirakit menjadi RTC dinamis yang besar, mengkatalisis sintesis RNA genom (replikasi) dan satu set RNA subgenomik (transkripsi), dan digunakan untuk mengoordinasikan ekspresi ORF yang terletak di hilir ORF1b (10? ? ?12).
RTC inti mencakup RNA polimerase yang bergantung pada RNA (RdRp) (13), superfamili 1 helicase (HEL1) (14, 15) dan beberapa enzim pemrosesan RNA, yang sebagian besar dikodekan dalam ORF1b dan dalam keluarga virus corona. Ini berisi nsp12-nsp16 dan nsp9-nsp12 dalam famili Arterioviridae (lihat referensi 10ââ 12).RdRp dan HEL1 mewakili dua (seperlima) domain yang dilestarikan dari virus sarang burung walet dan memiliki homologi di antara virus RNA lainnya.Replika inti diyakini dibantu oleh subunit lain, termasuk beberapa nsps kecil yang dilepaskan dari wilayah terminal karboksi (terminal C) pp1a, hilir Mpro (masing-masing virus corona nsp5 dan virus arteri nsp4).Mereka memiliki perlindungan khusus keluarga yang terbatas dan aktivitas yang beragam (diulas dalam referensi 10ââ12).
Baru-baru ini, sebuah domain dengan karakteristik motif urutan unik ditemukan di ujung amino (N-terminus) yang berdekatan dengan RdRp di semua virus yang bersarang, tetapi tidak pada virus RNA lainnya (16).Berdasarkan lokasi dan aktivitas nukleotida transferase (nukleosida monofosfat [NMP] transferase), domain ini diberi nama NiRAN (transferase nukleotida terkait Nestvirus RdRp).Kombinasi domain ganda NiRAN-RdRp merupakan nsp12 pada famili Coronaviridae dan nsp9 pada famili Arterioviridae, dan pada nestoviridae lainnya, NiRAN-RdRp diharapkan dapat dilepaskan sebagai nsp independen dari poliprotein virus.Dalam virus corona, domain NiRAN berisi residu ??1/450 dan terhubung ke domain C-terminal RdRp melalui wilayah linker (16?19).Dalam Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), nsp9 rekombinan menunjukkan aktivitas UMPylation dan GMPylation yang bergantung pada ion Mn2+ (mandiri), yang bergantung pada tiga basis urutan yang dilestarikan dalam nestovirus, AN, BN dan CN Residu dalam urutan tersebut.Dimana N adalah singkatan dari NiRAN) (16).Sisi N-terminal pada motif ini merupakan motif preAN yang kurang konservatif.Beberapa residu ini juga disimpan dalam protein kinase yang berkerabat jauh, di mana mereka telah terbukti terlibat dalam pengikatan nukleosida trifosfat (NTP) dan aktivitas katalitik (20, 21).Konsisten dengan pengamatan ini, beberapa residu situs aktif utama dalam pseudokinase SelO dari Pseudomonas syringae dapat dirakit dengan superkompleks SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 yang baru-baru ini diterbitkan.Residu NiRAN Virus Corona yang dilestarikan ditumpangkan dalam struktur mikro elektron.Protein rekombinan (17).Diperkirakan bahwa U/GMPylation (mandiri) yang terdokumentasi akan menghasilkan keadaan sementara untuk mentransfer NMP ke substrat (yang saat ini tidak diketahui) (16), dan kesamaan struktural antara NiRAN dan protein kinase (17, 19) ) Apakah hipotesisnya NiRAN memodifikasi protein lain.
Banyak fitur, termasuk hubungan sistematisnya yang unik dan unik dengan virus yang bersarang serta pemisahan genetik dari RdRp, menjadikan NiRAN sebagai enzim pengatur utama yang masuk akal untuk virus yang bersarang, yang sangat penting bagi kemunculan dan identitasnya.Sebelumnya, tiga kemungkinan fungsi yang melibatkan NiRAN untuk mengatur terjemahan genom/subgenomik atau replikasi/transkripsi telah disebutkan.Ketika mempertimbangkan data yang langka dan tidak lengkap yang tersedia pada saat itu, setiap fungsi memiliki kelebihan dan kekurangan (16).Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menggabungkan studi biokimia dan studi genetik terbalik dari virus corona yang mewakili kedua genera tersebut, dan menempatkan temuan kami dalam latar belakang evolusi mutasi alami keluarga virus corona, sehingga dapat memperoleh wawasan tentang dunia Misterius ini.Kami melaporkan kemajuan besar dalam pemahaman NiRAN melalui identifikasi target alami di RTC, yang (di antara tiga hipotesis yang tersedia) berkontribusi terhadap peran domain ini dalam memulai sintesis RNA virus yang bersarang.Penelitian ini juga membuka kemungkinan peran NiRAN lainnya pada antarmuka host virus.
Untuk mengkarakterisasi sifat enzimatik domain NiRAN terkait virus corona nsp12, kami menghasilkan bentuk rekombinan virus corona manusia 229E (HCoV-229E) nsp12 di E. coli, dengan tag His6 di terminal-C, dan menggabungkan protein dengan [α32-P ] Inkubasi bersama dengan NTP dengan adanya MnCl2 seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode.Analisis produk reaksi menunjukkan adanya protein berlabel radiolabel yang bermigrasi bersama dengan nsp12 (106 kDa), menunjukkan bahwa virus corona nsp12 mengkatalisis pembentukan produk tambahan protein-NMP kovalen, yang lebih disukai dibentuk dengan uridin monofosfat (UMP) (Gambar 1A) dan B).Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa dibandingkan dengan nukleotida lain, intensitas sinyal penggabungan UMP meningkat 2 hingga 3 kali lipat (Gambar 1C).Data ini konsisten dengan prediksi aktivitas NMP transferase domain NiRAN virus corona (16), namun menunjukkan bahwa preferensi nukleotida domain NiRAN virus corona dan virus arteri berbeda.
Aktivitas Self-NMPylation HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) diinkubasi dengan NTP [α-32P] yang ditunjuk dengan adanya 6 mM MnCl2 selama 30 menit (lihat Bahan dan Metode untuk rincian).Produk reaksi dipisahkan dengan SDS-PAGE dan diwarnai dengan warna biru cemerlang Coomassie.(B) Protein berlabel radiolabel divisualisasikan dengan pencitraan fosfor.Posisi nsp12-His6 dan penanda massa molekul protein (dalam kilodalton) ditunjukkan pada A dan B. (C) Intensitas sinyal radioaktif (rata-rata ± SEM) ditentukan dari tiga percobaan independen.*P≤0,05.Kekuatan sinyal (persentase) berhubungan dengan UTP.
Meskipun aktivitas enzim terkait NiRAN terbukti penting untuk replikasi EAV dan SARS-CoV dalam kultur sel (16), fungsi spesifik NiRAN dan target potensialnya belum ditentukan.Kesamaan struktural yang dilaporkan baru-baru ini antara NiRAN dan keluarga protein dengan lipatan mirip protein kinase (17, 22) mendorong kami untuk menguji hipotesis bahwa NiRAN mengkatalisis NMPylation protein lain.Kami menghasilkan serangkaian target homolog potensial, termasuk protein non-struktural yang dikodekan oleh HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), masing-masing berisi tag C-terminal His6 (lampiran SI, Tabel S1), Dan inkubasi protein ini dengan [α32-P] uridin trifosfat ([α32-P]UTP) dengan ada atau tidaknya nsp12.Albumin serum sapi dan protein fusi MBP-LacZα yang diproduksi di E. coli berperan sebagai kontrol (Gambar 2A, jalur 1 hingga 7).Protein berlabel radiolabel dianalisis dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan autoradiografi, dan ditemukan bahwa terdapat sinyal radioaktif yang kuat pada reaksi yang mengandung nsp12 dan nsp9.Posisi sinyal sesuai dengan massa molekul nsp9, menunjukkan UMPilasi nsp9 yang dimediasi nsp12 (Gambar 2B, jalur 7).Tidak ada protein uji lain yang ditemukan UMPylated, yang membuat kami menyimpulkan bahwa nsp9 adalah substrat spesifik nsp12.Konsisten dengan data self-NMPylation yang ditunjukkan pada Gambar 1, nsp12 mampu mentransfer keempat NMP ke nsp9, meskipun efisiensinya berbeda, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Gambar).3 A dan B).Dalam kondisi yang digunakan dalam pengujian ini (mempersingkat waktu reaksi dan pemaparan, mengurangi konsentrasi nsp12; bahan dan metode), self-NMPylation nsp12 tidak dapat dideteksi (bandingkan Gambar 2B, jalur 7, dan Gambar 1B), yang mana terbukti efektif (Dan beberapa putaran) UMP dipindahkan dari nsp12 ke nsp9.Aktivitas UMP transferase memerlukan adanya ion Mn2+, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3C, sementara hanya aktivitas UMP transferase minimal yang teramati dengan adanya Mg2+, dan tidak ada aktivitas dengan adanya dua kation divalen lainnya yang diuji.Data serupa diperoleh dalam pengujian NMPylation yang mengandung cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), dan adenosine triphosphate (ATP) (Lampiran SI, Gambar S1).
UMPilasi nsp9 yang dimediasi HCoV-229E nsp12.Serangkaian substrat protein (termasuk albumin serum sapi, MBP-lacZα, dan serangkaian nsps HCoV-229E berlabel C-terminal His6 yang dikodekan oleh ORF1a) digunakan untuk mengevaluasi aktivitas UMPylation dari HCoV-229E yang dimediasi nsp12-His6⁺ protein.Inkubasi protein dengan UTP [α-32P] selama 10 menit jika tidak ada (A) atau ada (B) nsp12 seperti yang dijelaskan dalam bahan dan metode.Di bagian atas A dan B, ditampilkan gel SDS-poliakrilamida yang diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue, dan di bagian bawah A dan B, autoradiogram yang sesuai ditampilkan.Posisi penanda massa molekul protein (dalam kilodalton) diberikan di sebelah kiri.Posisi nsp12-His6 (B, atas) dan sinyal radioaktif yang diamati selama inkubasi nsp12-His6 dengan nsp9-His6 (B, jalur 7) juga ditunjukkan, yang menunjukkan bahwa [α-32P]UMP hingga nsp9-His6 (12,9 kDa), yang tidak teramati untuk protein lain yang diuji.
HCoV-229E Karakterisasi biokimia dan virologi yang dimediasi NiRAN dari nsp9 NMPylation.(A dan B) Peran substrat nukleotida yang digunakan dalam reaksi.Nsp12-His6 dan nsp9-His6 dicampur dan diinkubasi dengan adanya NTP [α-32P] yang berbeda dalam uji NMPylation standar.(A, atas) nsp9-His6 bernoda Coomassie dipisahkan dengan SDS-PAGE.(A, bawah) Autoradiograf pada area gel yang sama.(B) Aktivitas relatif (rata-rata ± SEM) dengan adanya kofaktor nukleotida yang ditentukan ditentukan dari tiga percobaan independen.*P≤0,05.(C) Peran ion logam.Yang ditampilkan adalah uji NMPylation standar dengan adanya UTP [α-32P] dan ion logam berbeda, masing-masing dengan konsentrasi 1 mM.Di C, bagian atas, pewarnaan Coomassie nsp9-His6 ditampilkan, dan di C, bagian bawah, autoradiografi yang sesuai ditampilkan.Ukuran protein berlabel (dalam kilodalton) ditunjukkan di sebelah kiri A dan C. (D) Bentuk mutan HCoV-229E nsp12-His6 yang membawa substitusi asam amino tertentu ada dalam [α-32P]UTP, seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode.Nsp9-His6 berlabel radiologi yang dihasilkan dalam reaksi NMPylation dideteksi dengan pencitraan fosforilasi (D, atas).Aktivitas relatif dibandingkan dengan protein tipe liar (berat) ditunjukkan pada D, dan bagian bawah diambil sebagai rata-rata (±SEM) dari tiga percobaan independen.Tanda bintang menunjukkan penggantian residu yang tidak dilestarikan.(E) Titer virus dalam supernatan kultur sel p1 yang diperoleh 24 jam setelah infeksi ditentukan dengan uji plak.Substitusi kodon dalam domain NiRAN dari mutan HCoV-229E yang direkayasa ditunjukkan (penomoran residu didasarkan pada posisinya di pp1ab).Situs aktif RdRp mutan nsp12_DD4823/4AA yang kekurangan replikasi digunakan sebagai kontrol.
Untuk mendapatkan pemahaman lebih dalam tentang situs aktif NiRAN dan menentukan residu yang terkait dengan aktivitas NMP transferase spesifik nsp9, kami melakukan analisis mutasi, di mana kami mengganti residu konservatif dalam motif NiRAN AN, BN dan CN ( 16) Itu Ala (Lampiran SI, Gambar S2).Selain itu, dampak substitusi Arg-to-Lys atau Lys-to-Arg yang konservatif dievaluasi dalam dua kasus.Sebagai kontrol (negatif), residu virus corona yang tidak atau kurang terkonservasi dalam domain NiRAN dan virus bersarang lainnya diganti dengan Ala. Menggantikan K4116A (dalam motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) dan D4280A (CN) secara signifikan mengurangi atau bahkan menghilangkan nsp9 NMPylation melalui nsp12, sedangkan protein dengan substitusi konservatif (R4178K) , K4116R) mempertahankan 60% dan 80% aktivitasnya, yang menunjukkan bahwa pelonggaran pembatasan di sisinya masing-masing rantai sensitif secara fisikokimia (Gambar 3D).Mengganti beberapa residu lain yang dilestarikan E4145A, D4273A, F4281A dan D4283A jauh lebih tidak berbahaya, dan UMPylation nsp9 hanya berkurang sedikit.Hasil serupa diperoleh dalam reaksi NMPylation nsp9 yang melibatkan NTP lain (Gambar 3D dan lampiran SI, Gambar S3), membenarkan bahwa efek yang diamati pada substitusi asam amino spesifik tidak bergantung pada jenis substrat nukleotida yang digunakan.Selanjutnya, kami menguji kemungkinan dampak substitusi nsp12 terhadap replikasi virus corona dalam kultur sel.Untuk tujuan ini, kami menggunakan templat DNA komplementer hasil rekayasa genetika (cDNA) yang dikloning dalam virus vaccinia rekombinan (23, 24) untuk mentranskripsikan 5 -7 sel.Titrasi keturunan virus menular yang dihasilkan dalam sel-sel ini menunjukkan bahwa sebagian besar mutan HCoV-229E NiRAN tidak layak dilakukan (Gambar 3E).Sekelompok mutan virus yang tidak dapat hidup mencakup alternatif yang telah terbukti menghilangkan atau secara signifikan mengurangi aktivitas NMP transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), namun ada dua alternatif lain (K4116R, E4145A) 80 % disimpan?Aktivitas NMPylation in vitro menunjukkan adanya pembatasan tambahan.Demikian pula, dua mutasi lainnya (R4178K, F4281A) yang menyebabkan penurunan moderat pada aktivitas NMPilasi in vitro NiRAN menghasilkan virus hidup, namun virus ini secara signifikan mengurangi titer melalui replikasi.Konsisten dengan data aktivitas in vitro yang ditunjukkan pada Gambar 3D, menggantikan empat residu lain yang tidak disimpan dalam virus corona dan/atau virus bersarang lainnya (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) menghasilkan virus yang layak. titernya cukup berkurang dibandingkan dengan virus tipe liar (Gambar 3E).
Untuk mempelajari apakah aktivitas NMP transferase yang dimediasi NiRAN bergantung pada domain RdRp aktif, dua residu Asp yang dilestarikan yang terlibat dalam koordinasi ion logam divalen (11) dalam RdRp motif C digantikan oleh Ala. Protein yang dihasilkan nsp12_DD4823/4AA dipertahankan aktivitas NMPylation nsp9-nya, menunjukkan bahwa aktivitas NMPylation nsp9 in vitro yang dimediasi nsp12 tidak memerlukan aktivitas polimerase (Lampiran SI, Gambar S4).
Setelah menetapkan aktivitas transferase NMP spesifik nsp9 untuk nsp12, kami mencoba mengkarakterisasi hasil tambahan NMP-nsp9 dengan spektrometri massa (MS).Spektrum massa protein lengkap HCoV-229E nsp9 rekombinan menunjukkan puncak pada 12.045 Da (Gambar 4A).Penambahan nsp12 tidak mengubah kualitas nsp9, menunjukkan bahwa nsp12 dan nsp9 tidak akan membentuk kompleks yang stabil pada kondisi yang digunakan (denaturasi) (Gambar 4A).Dengan adanya UTP dan GTP, pengukuran massa reaksi yang mengandung nsp9 dan nsp12 masing-masing menunjukkan bahwa massa protein UTP berpindah 306 Da, dan massa protein GTP berpindah 345 Da, menunjukkan bahwa setiap molekul nsp9 mengikat UMP atau GMP. (Gambar 4) C dan D).Diperkirakan bahwa energi yang dibutuhkan untuk NMPylation nsp9 yang dimediasi NiRAN berasal dari hidrolisis NTP dan pelepasan pirofosfat.Meskipun molar nsp9 (target) berlebih 10 kali lipat dibandingkan nsp12 (enzim) yang digunakan dalam reaksi ini, NMPilasi nsp9 yang hampir lengkap diamati, menunjukkan bahwa interaksi antara nsp12 dan nsp9 berumur pendek, dan nsp12 dapat NMPylate lebih banyak nsp9 molekul in vitro.
NMPilasi tunggal nsp9 dengan adanya nsp12 dan UTP atau GTP.Yang ditampilkan adalah spektrum massa protein lengkap terdekonvolusi dari HCoV-229E nsp9 (Lampiran SI, Tabel S1) (AD).(A) nsp9 saja, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 dengan adanya UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 dengan adanya GTP.
Untuk menentukan residu nsp9 yang UMPylated oleh nsp12, nsp9-UMP dibelah dengan trypsin.Peptida yang dihasilkan dipisahkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi nano (HPLC) dan dianalisis dengan spektrometri massa tandem (MS/MS) online.Analisis data menggunakan paket perangkat lunak Byonic (Protein Metrics) menunjukkan UMPilasi asam amino terminal-N.Hal ini dikonfirmasi secara manual.Spektrum massa tandem dari peptida prekursor [UMP] NNEIMPGK (Lampiran SI, Gambar S5A) mengungkapkan sebuah fragmen pada 421 m/z, menunjukkan bahwa UMP berikatan dengan residu 1 nsp9.
Di ujung N nsp9, Asn dilestarikan di antara anggota Orthocoronavirinae (Lampiran SI, Gambar S6).Meskipun kami percaya bahwa nitrogen amina primer terminal-N adalah akseptor yang paling mungkin untuk UMP, kami memutuskan untuk mendapatkan bukti tambahan dari pengikatan NMP di terminal-N.Untuk alasan ini, peptida N-terminal nsp9 non-NMPylated dan NMPylated yang dimurnikan dengan HPLC diperoleh dengan adanya aseton dan natrium sianoborohidrida.Dalam kondisi ini, hanya amina primer bebas yang dapat dimodifikasi dengan propil (25).Peptida turunan nsp9 terminal-N dengan urutan NNEIMPGK mengandung dua amina primer, satu di ujung-N Asn dan yang lainnya di rantai samping Lys di ujung-C.Oleh karena itu, gugus propil dapat dimasukkan pada kedua ujungnya.Kromatogram ion yang diekstraksi dari peptida non-NMPylated ditunjukkan pada lampiran SI, Gambar S5B.Seperti yang diharapkan, peptida propilasi N-terminal dan C-terminal (mono) (lampiran SI, Gambar S5B, jalur atas) dan dipropilasi (lampiran SI, Gambar S5B, jalur bawah) dapat diidentifikasi.Pola ini berubah dengan penggunaan peptida N-terminal NMPylated dari nsp9.Dalam hal ini, hanya peptida propilasi terminal-C yang dapat diidentifikasi, tetapi peptida propilasi terminal-N dan peptida dipropilasi tidak diidentifikasi (Lampiran SI, Gambar S5C), yang menunjukkan bahwa UMP telah ditransfer ke amina primer terminal-N Untuk mencegah hal ini kelompok dari melakukan perubahan.
Selanjutnya, kami mengganti (dengan Ala atau Ser) atau menghapus residu yang dilestarikan di terminal-N nsp9 untuk menentukan batasan spesifik target.Berdasarkan data MS kami yang menunjukkan bahwa NiRAN membentuk hasil tambahan nsp9-NMP dengan amina primer dari residu N-terminal nsp9, kami berhipotesis bahwa NMPylation nsp9 memerlukan protease master virus (Mpro, nsp5) untuk melepaskan terminal N nsp9 dari prekursor poliproteinnya.Untuk menguji hipotesis ini, kami menghasilkan protein prekursor nsp7-11 yang mengandung nsp9 dalam E. coli dan melakukan uji NMPylation standar dengan adanya [α-32P] UTP (bahan dan metode).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A (jalur 3), prekursor nsp7-11 yang belum dipotong tidak diberi radiolabel dengan nsp12.Sebaliknya, jika nsp7-11 dibelah oleh nsp5 rekombinan untuk melepaskan nsp9 (dan nsps lainnya) dari prekursor, protein berlabel radiolabel yang bermigrasi dengan nsp9 terdeteksi, membenarkan kesimpulan kami bahwa NiRAN dan N- Pembentukan selektif dari hasil adisi kovalen nsp9-NMP .Amina primer terminal dari N-terminal Asn (posisi 3825 di pp1a/pp1ab).Kesimpulan ini juga didukung oleh eksperimen menggunakan konstruk nsp9, yang mengandung satu atau dua residu tambahan di terminal-N.Dalam kedua kasus, UMPylation nsp9 yang dimediasi NiRAN dihapuskan (Lampiran SI, Gambar S7).Selanjutnya, kami menghasilkan protein dengan satu atau dua residu Asn yang dihapus dari urutan peptida 3825-NNEIMPK-3832 di terminal-N nsp9.Dalam kedua kasus, nsp9 UMPylation diblokir sepenuhnya (Gambar 5B), memberikan bukti tambahan bahwa nsp9 N-terminus yang sebenarnya bertindak sebagai reseptor NMP.
Pemrosesan proteolitik nsp9 dan peran residu N-terminal dalam UMPylation yang dimediasi nsp12.(A) UMPylation nsp9 memerlukan terminal N nsp9 gratis.Nsp7-11-His6 dipra-inkubasi pada suhu 30 °C dalam buffer deteksi NMPylation yang mengandung UTP dengan ada atau tidaknya Mpro rekombinan (nsp5-His6).Setelah 3 jam, mulailah pengujian NMPylation dengan menambahkan nsp12-His6 seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode.Reaksi yang mengandung nsp5-His6 (jalur 1) dan nsp9-His6 (jalur 2) digunakan sebagai kontrol.Setelah 10 menit, reaksi dihentikan dan campuran reaksi dipisahkan dengan SDS-PAGE.Protein diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue (A, atas).Prekursor Nsp7-11-His6 dan produk olahan yang dihasilkan dari pembelahan yang dimediasi nsp5-His6 ditunjukkan di sebelah kanan.Harap dicatat (karena ukurannya yang kecil) bahwa nsp7 dan nsp11-His6 tidak terdeteksi dalam gel ini, dan reaksinya dilengkapi dengan nsp5-His6 (jalur 1 dan 4; posisi nsp5-His6 ditandai dengan lingkaran padat) atau nsp9-His6 (Lajur 2) mengandung sejumlah kecil MBP (ditunjukkan dengan lingkaran terbuka) sebagai pengotor sisa karena dinyatakan sebagai protein fusi MBP (lampiran SI, Tabel S1).(B) Varian Nsp9-His6 tidak memiliki satu atau dua residu Asn terminal-N (penomoran residu sesuai posisi di pp1a/pp1ab) dan dimurnikan serta diinkubasi dengan nsp12-His6 dan [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE yang diwarnai dengan Coomassie ditampilkan di bagian atas, B, autoradiograf yang sesuai ditampilkan di bagian bawah.Posisi penanda berat molekul (dalam kilodalton) ditunjukkan di sebelah kiri.(C) Residu yang dilestarikan terminal N HCoV-229E nsp9-His6 diganti dengan Ala atau Ser, dan jumlah protein yang sama digunakan dalam reaksi UMPylation yang dimediasi nsp12-His6.Produk reaksi dipisahkan oleh SDS-PAGE dan diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue (C, atas), dan nsp9-His6 yang diberi radiolabel dideteksi dengan pencitraan pendar (C, tengah).Menggunakan protein tipe liar (berat) sebagai referensi (diatur ke 100%), aktivitas NMPylation relatif (rata-rata ± SEM) dihitung dari tiga percobaan independen.(D) Titer virus dalam supernatan kultur sel p1 dari sel Huh-7 yang terinfeksi sel Huh-7 tipe liar HCoV-229E, dan mutan yang membawa substitusi asam amino khusus di nsp9 ditentukan dengan uji plak.RdRp motif C mutan ganda DD4823/4AA yang kekurangan replikasi digunakan sebagai kontrol negatif.
N-terminus nsp9 (khususnya posisi 1, 2, 3, dan 6) sangat terpelihara di antara anggota subfamili Orthocoronavirinae (Lampiran SI, Gambar S6).Untuk mempelajari kemungkinan peran residu ini dalam NMPylation nsp9 yang dimediasi nsp12, dua residu Asn berturut-turut di ujung-N nsp9 diganti dengan Ala atau Ser (sendiri atau dalam kombinasi).Dibandingkan dengan nsp9 tipe liar, mengganti N3825 dengan Ala atau Ser menghasilkan lebih dari dua kali lipat pengurangan UMPylation yang dimediasi nsp12 (Gambar 5C).Konsisten dengan kesimpulan kami bahwa NMPylation terjadi pada amina primer terminal-N dan bukannya rantai samping residu terminal-N, kami mengamati sisa NMPylation yang signifikan dengan penggantian N3825A dan N3825S.Menariknya, jika Asn kedua digantikan oleh Ala atau Ser, UMPylation nsp9 berkurang lebih kuat (lebih dari 10 kali), sedangkan penggantian Ala pada posisi 3, 4, dan 6 hanya memiliki efek moderat pada nsp9 UMPylation (Gambar 2 ) .5C).Hasil serupa diperoleh dengan menggunakan ATP, CTP atau GTP (Lampiran SI, Gambar S8).Secara kolektif, data ini menunjukkan peran kunci N2826 (posisi 2 di nsp9) dalam nsp9 NMPylation.
Untuk mendapatkan bukti tambahan tentang korelasi fungsional antara N-terminus nsp9 dan NMPylation, kami melakukan penyelarasan beberapa urutan (MSA) dari urutan nsp9 dari keluarga virus Corona (bervariasi antara 104 dan 113 residu) (Lampiran SI, Gambar S6).Secara total, pada 47 spesies (yang diketahui dan diduga) dari 5 genera subfamili Orthocoronavirinae yang menginfeksi berbagai mamalia, burung, dan inang reptil, hanya 8 residu yang ditemukan bersifat invarian.Perubahan paling luas, termasuk penghapusan dan penyisipan, diamati pada siklus antara elemen struktur sekunder nsp9, sebagaimana ditentukan oleh studi struktural sebelumnya (26??28).Lima residu invarian ditemukan di untai β dan heliks α dari bagian terminal C nsp9.Tiga residu invarian merupakan motif NNE dari ujung N nsp9.Terungkap bahwa Asn kedua dari motif ini adalah satu-satunya residu invarian, yang juga dimiliki oleh nsp9 hipotetis dari virus corona katak yang berkerabat jauh, dan mewakili spesies Microhyla letovirus 1 di subfamili Letovirinae dari Alphaletovirus.Konservasi residu dalam elemen struktur sekunder nsp9 dapat dirasionalisasikan dengan pertimbangan struktural untuk mempertahankan sifat pengikatan RNA lipat atau yang diketahui.Namun, alasan ini tampaknya tidak berlaku untuk konservasi NNE, dan sebelum penelitian ini, sifat kendala yang membatasi variasi urutan tripeptida sepenuhnya dikaburkan.
Untuk menentukan pentingnya nsp9-NMPylation dan konservasi NNE dalam replikasi virus corona, kami memproduksi mutan HCoV-229E, yang membawa substitusi tunggal atau ganda dari residu terminal N nsp9, yang menunjukkan bahwa nsp9 NMPylation berbahaya secara in vitro.Sebelum kita mulai, kami mencoba menjawab pertanyaan apakah substitusi ini (dekat situs pembelahan nsp8|9) mempengaruhi pemrosesan proteolitik wilayah C-terminal pp1a.Satu set konstruksi poliprotein nsp7-11 yang mengandung substitusi yang sesuai di terminal-N nsp9 diproduksi di E. coli dan dipotong dengan Mpro rekombinan.Pembelahan proteolitik dari empat situs (termasuk situs mengapit nsp9) tidak terpengaruh secara signifikan oleh substitusi apa pun yang diperkenalkan (lampiran SI, Gambar S9), tidak termasuk perubahan struktural pada protein ini yang mengganggu pembelahan nsp8|9 yang dimediasi Mpro (Atau lainnya) situs web.
Sel Huh-7 ditransfeksi dengan RNA HCoV-229E sepanjang genom, yang mengkode substitusi Ala atau Ser dalam tripeptida NNE yang dilestarikan (N3825, N3826, dan E3827) di terminal nsp9 N, menunjukkan bahwa sebagian besar mutasi berakibat fatal.Kami dapat menyelamatkan virus dengan mengganti Ser atau Ala dari N-terminal Asn (N2835A atau N2835S), namun gagal memulihkan virus dengan mutasi tunggal dan ganda lainnya dalam urutan NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Gambar 5D).
Hasil ini menunjukkan bahwa replikasi virus corona dalam kultur jaringan terbatas (sama atau serupa), membatasi mutasi alami situs NMPylation nsp9 di dalam tubuh, dan mendukung peran kunci respons ini dalam siklus hidup virus corona.
Pada rangkaian percobaan terakhir, kami memproduksi C-terminal His6 berlabel SARS-CoV-2 nsp12 dan nsp9, dan dua bentuk mutan nsp12 pada E. coli.Residu situs aktif dalam domain NiRAN dan RdRp masing-masing menggunakan Ala (Gambar 6A dan lampiran SI, Tabel S2).K4465 pada SARS-CoV-2 nsp12 sama dengan K4135 pada HCoV-229E (Lampiran SI, Gambar S2), yang terbukti diperlukan untuk aktivitas NiRAN dan replikasi HCoV-229E (Gambar 3D dan E).Residu ini juga berhubungan dengan residu virus arteri EAV nsp9 K94, yang sebelumnya terbukti diperlukan untuk self-UMPylation/self-GMPylation NiRAN (16).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6B, SARS-CoV-2 nsp12 memiliki aktivitas transferase UMP menggunakan nsp9 sebagai substrat, sedangkan mutan situs aktif nsp12_K4465A tidak aktif.Substitusi ganda pada rangkaian karakteristik SDD RdRp motif C tidak mempengaruhi aktivitas transferase UMP (Gambar 6B), menunjukkan bahwa aktivitas RdRp tidak memiliki efek langsung pada UMPylation nsp9.Data serupa diperoleh dengan menggunakan CTP, GTP dan ATP (lampiran SI, Gambar S10).Singkatnya, data ini menunjukkan bahwa NMPylation nsp9 yang dimediasi NiRAN memiliki aktivitas konservatif pada virus corona yang mewakili genera berbeda dari subfamili ortocoronavirus.
NMPilasi nsp9 yang dimediasi SARS-CoV-2 nsp12.(A) Gel SDS-poliakrilamida bernoda Coomassie menunjukkan protein rekombinan yang digunakan dalam uji NMPylation.Sebagai kontrol, digunakan protein mutan dengan substitusi situs aktif pada domain NiRAN (K4465A) dan domain RdRp (DD5152/3AA) dari SARS-CoV-2 nsp12.Penomoran residu didasarkan pada posisi di pp1ab.(B) Autoradiograf deteksi UMPylation menggunakan nsp9-His6 dan [α-32P]UTP sebagai substrat nsp12-His6 (tipe liar [wt] dan mutan).Massa molekul (dalam kilodalton) dari protein berlabel ditunjukkan di sebelah kiri.
Domain NiRAN umumnya disimpan dalam Nidovirales (16), menunjukkan bahwa domain tersebut mengkatalisis reaksi enzimatik yang penting untuk replikasi Nidovirus.Dalam penelitian ini, kami dapat membuktikan bahwa domain NiRAN dari virus corona mentransfer NMP (dihasilkan dari NTP) ke nsp9, protein pengikat RNA misterius yang terlibat dalam replikasi virus (26 ?? 29 ), untuk menentukannya sebagai target alami dan mitra RTC virus corona.
Domain NiRAN berbagi tiga motif sekuens (AN, BN, dan CN), yang mengandung sejumlah kecil residu yang dilestarikan di semua famili dalam ordo Nidovirales yang monofiletik tetapi sangat terdiferensiasi (8, 16).Penelitian terbaru menunjukkan bahwa mereka secara struktural terkait dengan keluarga protein mirip protein kinase yang sebagian besar tidak berkarakteristik, yang awalnya disebut keluarga SelO (17, 19, 22, 30, 31).Protein yang berhubungan dengan SelO memiliki lipatan kinase, namun kekurangan beberapa residu situs aktif yang dilestarikan dalam kinase klasik (22, 32).Berdasarkan orientasi terbalik molekul ATP yang terikat ke situs aktif dan distabilkan oleh interaksi spesifik, SelO dihipotesiskan dan kemudian dikonfirmasi untuk mentransfer AMP (bukan fosfat) ke substrat protein (22), sementara protein mirip SelO bakteri lainnya, YdiU, memiliki baru-baru ini terbukti mengkatalisis perlekatan kovalen UMP ke Tyr dan residu-residunya pada substrat protein yang berbeda (33).
Untuk mengkonfirmasi dan memperluas prediksi residu situs aktif yang diduga dari domain NiRAN virus corona, kami menggunakan metode biokimia dan genetika terbalik untuk melakukan analisis mutasi pada virus corona nsp12 (Gambar 3D dan lampiran E dan SI, Gambar S3 dan tabel) S1â S4).Data menunjukkan bahwa penggantian HCoV-229E K4135, R4178 dan D4280 dengan Ala menghilangkan aktivitas NMP transferase in vitro dan replikasi virus dalam kultur sel (Gambar 3D dan lampiran E dan SI, Gambar S3), mendukung keberadaan mereka di NTP γ-fosfat (K4135, R4178) dan koordinasi ion logam situs aktif (D4280).Substitusi Glu yang dilestarikan dengan E4145A dalam kisaran virus sarang burung walet yang diprediksi menstabilkan posisi K4135 (17) terbukti menghilangkan replikasi virus, namun yang mengejutkan, aktivitas tersebut tetap dipertahankan dalam uji NMPylation in vitro (Gambar 3D dan E dan Lampiran SI, Gambar S3 Dan Tabel S1–S4).Pengamatan serupa dilakukan ketika substitusi yang sesuai diperkenalkan pada homolog YdiU dari Salmonella typhimurium (E130A) (33).Secara keseluruhan, data ini mendukung fungsi pengaturan residu yang dilestarikan ini dibandingkan fungsi katalitik.
Mengganti residu Phe yang dilestarikan (F4281A) dalam kisaran nestovirus dalam domain HCoV-229E NiRAN (8) mengakibatkan penurunan aktivitas NMPylation in vitro dan penurunan replikasi virus yang signifikan dalam kultur sel (Gambar 3D, E dan SI) lampiran, Gambar S3).Data tersebut konsisten dengan fungsi pengaturan penting dari residu ini, seperti residu Phe motif DFG homolog yang ditunjukkan sebelumnya.Dalam protein kinase klasik, ini adalah bagian dari loop pengikatan Mg2+ dan membantu merakit dan mengatur tulang belakang???Diperlukan untuk aktivitas katalitik yang efektif (32, 34).Mengganti residu K4116 dengan Ala dan Arg (dalam motif preAN), masing-masing, menghilangkan replikasi virus dan, seperti yang diharapkan, memiliki efek berbeda pada aktivitas NMP transferase in vitro, tergantung pada rantai samping asam amino yang dimasukkan (Gambar 3D dan lampiran E dan SI , Gambar S3).Data fungsional konsisten dengan informasi struktural, menunjukkan bahwa residu ini telah membentuk interaksi dengan ATP fosfat (17).Dalam domain NiRAN keluarga virus bersarang lainnya, posisi HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ditempati oleh Lys, Arg atau His (8), yang menunjukkan bahwa pembatasan fungsional residu spesifik ini telah dilonggarkan.Substitusi D4188A dan D4283A menghilangkan atau sangat mengurangi aktivitas enzim dan menghilangkan replikasi virus (Gambar 3).Kedua residu ini tersimpan di sebagian besar (tetapi tidak semua) virus yang bersarang (8), yang menunjukkan fungsi khusus keluarga yang penting tetapi mungkin non-katalitik.Substitusi Ala dari beberapa residu Lys dan Asp lainnya (K4113A, D4180A, D4197A dan D4273A) yang tidak dilestarikan dalam Coronaviridae atau famili Nestioviridae lainnya (8) digunakan sebagai kontrol.Seperti yang diharapkan, substitusi ini sebagian besar dapat ditoleransi, dengan sedikit penurunan aktivitas enzim dan replikasi virus dalam beberapa kasus (Gambar 3 dan lampiran SI, Gambar S3).Secara keseluruhan, data mutagenesis virus corona sangat konsisten dengan data self-GMP dan reverse genetika EAV NiRAN-RdRp (16), di mana residu EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (sesuai dengan HCoV-229E K4135) berfungsi penting), R124 (sesuai dengan R4178), D132 (sesuai dengan D4188), D165 (sesuai dengan D4280), F166 (sesuai dengan F4281).Selain itu, data mutagenesis HCoV-229E konsisten dengan dan diperluas dari data genetik terbalik SARS-CoV yang dilaporkan sebelumnya (16), sama seperti yang diamati pada motif CN terkait Phe-to-Ala mutan SARS-CoV_nsp12 fenotipe yang dijelaskan -F219A dan HCoV-229E_F4281A (Gambar 3 lampiran D dan E dan SI, Gambar S3 dan Tabel S1-S4).
Dibandingkan dengan ahli ortolog EAV (16), yang memiliki preferensi yang jelas terhadap UTP dan GTP (dalam reaksi NMPylation mandiri), penelitian kami menunjukkan bahwa domain virus corona NiRAN (diwakili oleh HCoV-229E dan SARS-CoV-2) dapat secara efektif ditransfer Keempat NMP, meskipun ada sedikit preferensi untuk UMP (Gambar 1 dan 3).Spesifisitas yang relatif rendah dari ko-substrat NTP spesifik konsisten dengan struktur superkomposit SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 yang baru-baru ini dilaporkan, di mana ADP-Mg2+ berikatan dengan situs aktif NiRAN, namun tidak dengan bagian adenin. pembentukan interaksi spesifik (17).Dalam penelitian kami, jenis nukleotida yang digunakan dalam reaksi NMPylation tidak memiliki efek diferensial pada aktivitas protein mutan (Lampiran SI, Gambar S3), menunjukkan bahwa tidak ada residu yang terkait erat dengan pengikatan nukleobase tertentu.Dasar struktural dan potensi signifikansi biologis dari preferensi co-substrat NTP yang berbeda yang diamati dalam domain NiRAN dari virus corona dan virus arteri masih harus dipelajari;mungkin benar atau mungkin karena keterbatasan penelitiannya masing-masing.Saat ini, tidak dapat dikesampingkan bahwa potensi aktivitas NMPylator dari domain virus arteri NiRAN (dibandingkan dengan aktivitas NMPylation mandiri yang dikarakterisasi sebelumnya) memiliki preferensi ko-substrat yang berbeda, dengan mempertimbangkan kesamaan antara arteri dan virus corona. Domain NiRAN sudah mencapai batasnya.Perbandingan Berbasis Urutan (16).Dibandingkan dengan pseudokinase SelO, yang menggunakan Mg2+ sebagai kofaktor, aktivitas virus corona dan virus arteri NiRAN bergantung pada Mn2+ (16) (Gambar 3C dan lampiran SI, Gambar S1).Ketergantungan Mn2+ dan preferensi yang jelas terhadap UTP adalah fitur yang tidak biasa dari protein NMPylator, dan baru-baru ini dikonfirmasi dalam protein YdiU dari Salmonella typhimurium, yang mengkatalisis UMPylation pendamping protein yang bergantung pada Mn2+ untuk melindungi sel dari induksi stres. Kumpulan ATP sel ( 33).
Kesamaan struktural yang dijelaskan baru-baru ini antara domain NiRAN virus corona dan protein kinase seluler (17, 19) memberikan dukungan tambahan terhadap kemampuan NiRAN untuk menghubungkan NMP secara kovalen dengan protein lain yang telah kami laporkan dalam penelitian ini.Kami memfokuskan pencarian kami untuk kemungkinan target NiRAN pada protein yang dikodekan oleh HCoV-229E ORF1a, yang diketahui secara langsung atau tidak langsung membantu replikase yang dikodekan ORF1b RTC (12, 35).Eksperimen kami memberikan bukti konklusif untuk NMPilasi nsp9 yang efektif dan spesifik (Gambar 2).Jika protein target digunakan dalam kelebihan molar yang 8 hingga 10 kali lebih tinggi dibandingkan enzim (nsp12), dipastikan bahwa nsp9 sepenuhnya (mono)NMPized (Gambar 4).Kami menyimpulkan bahwa interaksi antara nsp12 dan nsp9 berumur pendek dan tidak akan membentuk kompleks yang stabil dengan nsp9 (jika tidak ada subunit RTC lainnya).Kesimpulan ini didukung oleh studi interaksi protein pada proteom SARS-CoV (35).Analisis MS mengidentifikasi amina primer dari residu N-terminal nsp9 sebagai situs NMPylation (Lampiran SI, Gambar S5).Pembentukan ikatan fosforamidat dan gugus amino terminal-N membedakan aktivitas NMPilasi yang dimediasi NiRAN dari reaksi AMPilasi yang dimediasi oleh Pseudomonas syringae SelO, yang mengkatalisis pembentukan AMP terkait-O pada residu Ser, Thr, atau Tyr yang ditambahkan Peptida ( 22), dan S. typhimurium YdiU membentuk hasil tambahan peptida-UMP terkait-O (dengan Tyr) dan terkait-N (dengan His).Terbatasnya informasi yang tersedia mengenai keluarga protein SelO menunjukkan bahwa anggota keluarga protein besar ini sangat berbeda dalam pembentukan produk tambahan peptida-NMP.Ini adalah pengamatan menarik yang perlu dipelajari lebih lanjut.
Data yang diperoleh dalam penelitian ini mengarahkan kami pada hipotesis bahwa NMPilasi nsp9 memerlukan N-terminus bebas.Dalam konteks replikasi virus, hal ini akan terjadi melalui pembelahan proteolitik dari tempat pemrosesan nsp8|nsp9 dalam replika poliprotein pp1a yang dimediasi oleh Mpro dan pp1ab.Pada sebagian besar virus corona, perbedaan antara situs spesifik ini (VKLQ|NNEI dalam HCoV-229E) dan semua situs pembelahan Mpro virus corona lainnya adalah Asn (bukan residu kecil lainnya, seperti Ala, Ser, atau Gly) yang menempati P1â???Lokasi (36).Data pembelahan peptida yang diperoleh dalam penelitian awal menunjukkan bahwa efisiensi pembelahan situs nsp8|nsp9 lebih rendah dibandingkan situs lain, yang menunjukkan bahwa 1) situs spesifik ini mungkin memiliki peran pengaturan dalam pemrosesan terminal-C yang terkoordinasi secara tepat waktu wilayah pp1a, atau 2) a Peran terminal N nsp9 khusus yang dilestarikan dalam replikasi virus (37).Data kami (Gambar 5A) menunjukkan bahwa bentuk rekombinan nsp9 yang membawa urutan N-terminal sebenarnya secara efektif di-NMP-kan oleh nsp12.Urutan mengapit terminal-N dihilangkan oleh faktor Xa (nsp9-His6; lampiran SI, Tabel S1) atau pembelahan yang dimediasi Mpro (nsp7-11-His6; Gambar 5A dan lampiran SI, Tabel S1).Yang penting, prekursor yang mengandung nsp9 yang tidak dipotong, nsp7-11-His6, menunjukkan resistensi terhadap NMPilasi nsp12, yang konsisten dengan data kami, menunjukkan bahwa hasil aduk nsp9-NMP dibentuk melalui amina primer terminal-N (Lampiran SI, Gambar S5) .Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih dalam tentang spesifisitas substrat NiRAN, kami kemudian fokus pada residu N-terminal nsp9 yang berdekatan.Dengan tidak adanya protein lain, mereka fleksibel secara struktural, mencegahnya terdeteksi dalam bentuk nsp9 yang tidak berlabel (26 28, 38), yang menunjukkan variasi alaminya yang terbatas. Hal ini disebabkan oleh urutan spesifik yang penting (tidak terkait dengan struktur sekunder) fungsi dari fragmen N-terminal nsp9.Substitusi residu yang dilestarikan di wilayah ini (Gambar 5C dan D dan lampiran SI, Gambar S8) mengungkapkan bahwa N3826 penting untuk nsp9 NMPylation in vitro, sedangkan substitusi N3825A dan E3827A menyebabkan penurunan NMPylation, sedangkan substitusi M3829A dan P3830A tidak menyebabkan penurunan NMPylation. .Jelas mempengaruhi nsp9 NMPylation.Meskipun substitusi N-terminal Asn (N3825A, N3825S) hanya memiliki efek moderat pada nsp9 NMPylation dan replikasi virus dalam kultur sel (Gambar 5C dan D), penghapusan urutan residu Asn dari dipeptida N-terminal 3825-NN terbukti Ini mematikan bagi virus, menunjukkan bahwa satu residu Asn diperlukan sebelum residu lain di terminal-N, lebih disukai Asn, meskipun tampaknya substitusi residu serupa dapat ditoleransi sebagian (Gambar 5B, C, dan D).Kami menyimpulkan bahwa dipeptida 3825-NN, terutama residu N3826 yang dilestarikan dan esensial dalam kisaran virus corona (lampiran SI, Gambar S6), memastikan pengikatan dan orientasi yang benar dari terminal N nsp9 di situs aktif NiRAN.
Mengganti Ala (E3827A) untuk Glu yang dilestarikan dari semua subfamili mempertahankan nsp9 NMPylation in vitro tetapi mematikan bagi virus dalam kultur sel (Gambar 5C dan D), yang menunjukkan fungsi tambahan dari residu ini, misalnya, dalam interaksi utama (NMPylated atau tidak dimodifikasi ) nsp9 N-terminus dan faktor lain yang terlibat dalam replikasi virus.Mutasi Nsp9 tidak mempengaruhi proses proteolitik nsp9 atau nsps yang berdekatan (39) (Lampiran SI, Gambar S9), menunjukkan bahwa fenotipe mematikan dari beberapa mutasi nsp9 yang diamati tidak disebabkan oleh disregulasi area terminal proses proteolitik C pp1a .
Data di atas memberikan bukti bahwa setelah perlakuan yang dimediasi Mpro pada situs pembelahan nsp8|9 di pp1a/pp1ab, N-terminus nsp9 dapat di-UMPylated (atau dimodifikasi sebagian dengan NMP lain).Selain itu, konservasi yang sangat baik dari N-terminus nsp9 (termasuk residu Asn tunggal dan invarian dalam keluarga virus corona) dan data genetika terbalik yang diperoleh dalam penelitian ini (Gambar 3E dan 5D) mengarahkan kami pada kesimpulan bahwa NMPylation nsp9 yang dijelaskan terkait secara biologis dan penting untuk replikasi virus corona.Konsekuensi fungsional dari modifikasi ini masih harus dipelajari, misalnya, mengenai aktivitas pengikatan RNA nsp9 (bentuk tidak dimodifikasi) yang dijelaskan sebelumnya (non-spesifik) (2628).NMPilasi N-terminal juga dapat mempengaruhi interaksi nsp9 dengan substrat protein atau RNA atau pembentukan rakitan empat tingkat yang berbeda.Hal ini telah diamati dalam studi struktural dan telah dikonfirmasi secara fungsional terkait dengan replikasi virus corona, meskipun tidak ada perubahan dalam kasus modifikasi ini (26-ââ29, 40).
Meskipun spesifisitas target domain NiRAN virus corona masih perlu dikarakterisasi lebih detail, data kami menunjukkan bahwa spesifisitas target protein domain NiRAN virus corona sangat sempit.Meskipun konservasi residu situs aktif utama (8, 16) dalam domain NiRAN dari semua keluarga nidovirus sangat mendukung aktivitas NMPylator yang dilestarikan protein ini, identitas residu kantong pengikat substrat dari domain ini Konservasi dan konservasi tetap harus dikarakterisasi , dan mungkin berbeda antara kelompok tujuan Nidovirales yang berbeda.Demikian pula, target relevan dari virus bersarang lainnya masih belum ditentukan.Mereka mungkin merupakan ortolog jarak jauh dari nsp9 atau protein lain, karena urutan di luar lima domain replikase yang umumnya disimpan dalam virus yang bersarang kurang terkonservasi (8), termasuk susunan genom antara Mpro dan NiRAN, Diantaranya, nsp9 terletak di virus corona.
Selain itu, saat ini kami tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa domain NiRAN memiliki target tambahan (termasuk seluler).Dalam hal ini, perlu disebutkan bahwa homolog bakteri dalam protein NMPylator (NMPylator) (30, 31) yang baru muncul ini tampaknya memiliki “pengatur utama”?NMP memodulasi berbagai protein seluler untuk mengatur atau menghilangkan aktivitas hilirnya, sehingga berperan dalam berbagai proses biologis, seperti respons stres seluler dan homeostasis redoks (22, 33).
Dalam penelitian ini (Gambar 2 dan 4 dan Lampiran SI, Gambar S3 dan S5), kami dapat membuktikan bahwa nsp12 memindahkan bagian UMP (NMP) ke posisi tunggal (dikonservasi) di nsp9, sementara protein lain tidak dimodifikasi dalam digunakan Dalam kondisi tersebut, spesifisitas media yang terdefinisi dengan baik (bukan longgar) didukung.Konsisten dengan hal ini, dibandingkan dengan N-terminal nsp9 NMPylation, aktivitas NMPylation nsp12 sendiri sangat rendah, pendeteksiannya memerlukan waktu pemaparan autoradiografi yang lebih lama, dan digunakan peningkatan konsentrasi nsp12 sebesar 10 kali lipat.Selain itu, analisis MS kami gagal memberikan bukti untuk NMPylation nsp12, yang menunjukkan bahwa NMPylation mandiri domain NiRAN (paling banter) adalah aktivitas sekunder.Namun, perlu dicatat bahwa penelitian lain telah memberikan bukti awal bahwa status self-AMPylation dari NMPylator bakteri dapat mengontrol aktivitas NMPylation mereka pada substrat protein lain (22, 33).Oleh karena itu, diperlukan lebih banyak penelitian untuk menyelidiki kemungkinan efek fungsional dari aktivitas NMPylation mandiri yang dilaporkan untuk EAV nsp9 (16) dan virus corona nsp12 (penelitian ini), termasuk usulan efek seperti pendamping pada pelipatan domain RdRp terminal-C ( 16) ).
Sebelumnya, beberapa hipotesis mengenai kemungkinan fungsi hilir domain NiRAN nidoviral telah dipertimbangkan, termasuk RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase dan aktivitas protein priming (16), namun tidak satupun yang kompatibel dengan fungsi hilir yang tersedia.Informasi yang diperoleh pada posisi berikut ini adalah waktu yang sama persis tanpa membuat asumsi tambahan.Data yang diperoleh dalam penelitian ini paling konsisten (tetapi tidak dapat membuktikan) bahwa domain NiRAN terlibat dalam inisiasi sintesis RNA yang diinduksi protein.Sebelumnya diyakini bahwa fungsi domain NiRAN di 5??Pembatasan ²-RNA atau reaksi ligasi RNA tidak terpengaruh oleh hal ini dan Dukungan data lainnya.Oleh karena itu, misalnya, situs aktif NiRAN dianggap melibatkan Asp yang dilestarikan sebagai basis umum (D252 pada Pseudomonas syringae SelO; D4271 pada HCoV-229E pp1ab; D208 pada SARS-CoV-2 nsp12) (Lampiran SI, gambar 2 ).S2) (17, 22, 33), sedangkan katalisis pada ligase RNA yang bergantung pada ATP dan enzim penutup RNA dilakukan oleh zat antara enzim kovalen-(lisil-N)-NMP, yang melibatkan residu Lys yang tidak berubah ( 41).Selain itu, spesifisitas NiRAN virus corona berbasis urutan yang luar biasa untuk target protein yang dilestarikan dan spesifisitas yang lebih longgar untuk ko-substrat NTP (lebih memilih UTP) menentang enzim pembatasan yang dimediasi NiRAN atau fungsi mirip RNA ligase.
Jelas, banyak pekerjaan ekstra diperlukan untuk memverifikasi dan, jika terbukti, menguraikan kemungkinan peran nsp9-UMP (nsp9-NMP) dalam sintesis RNA yang diinduksi protein, yang akan menghubungkan beberapa laporan menarik namun (sejauh ini) yang dilaporkan sebelumnya. .Pengamatan terisolasi.Misalnya, telah ditentukan bahwa ujung untai negatif RNA virus corona dimulai dengan untai oligo(U) (42, 43).Pengamatan ini konsisten dengan gagasan bahwa sintesis RNA untai negatif dimulai dengan mengikat bentuk nsp9 yang terumpil ke ekor poli(A) (pemicu), yang dapat didorong oleh pengikatan RNA-nya. Aktivitas dan/atau interaksi dengan protein RTC lainnya.Bagian UMP yang disediakan oleh nsp9 kemudian dapat digunakan sebagai “primer” untuk oligouridilasi yang dimediasi nsp7/8/nsp12, menggunakan ekor 3??²-poli(A) dalam RNA genom atau rangkaian yang mengandung oligo (A) lainnya berfungsi sebagai templat, mirip dengan mekanisme yang dibuat untuk protein VPg picornavirus (44).Bagaimana jika usulan tersebut “non-normatif”????Inisiasi sintesis RNA untai negatif (yang diinduksi oleh protein) memberikan kaitan dengan pengamatan, yang menunjukkan bahwa RNA untai negatif virus corona memiliki UMP (bukan UTP) di ujungnya (42), yang dianggap menunjukkan bahwa asam nukleat Pemain dadu membelah ujung yang difosforilasi oleh endonuklease spesifik uridin yang tidak diketahui.Jika dikonfirmasi, aktivitas hidrolitik asam nukleat ini dapat membantu melepaskan bentuk nsp9 oligomer UMPylated dari ujung 5 ² untai negatif yang baru lahir.Kemungkinan peran nsp9 dalam priming protein juga konsisten dengan penelitian genetika terbalik sebelumnya, yang menunjukkan bahwa nsp9 (dan nsp8) berinteraksi secara kritis dan spesifik dengan elemen RNA yang bertindak cis yang dilestarikan di dekat ujung ke-3 genom virus corona.45).Menurut laporan ini, pengamatan sebelumnya kini dapat dikaji ulang dan diperluas melalui penelitian lebih lanjut.
Singkatnya, data kami menentukan aktivitas spesifik dari tag enzim virus bersarang yang ditautkan ke RdRp di terminal-N.Pada virus corona, aktivitas UMPylator/NMPylator yang dimediasi NiRAN yang baru ditemukan ini digunakan untuk mengandalkan Mn2+ dan residu Asn yang berdekatan serta menyebabkan pembentukan ikatan fosforamidat (energi rendah) dengan amina primer terminal-N.Melalui pembelahan yang dimediasi Mpro di situs pembelahan nsp8|9, target nsp9 dapat digunakan untuk NMPylation, yang menunjukkan penggabungan fungsional antara protease dan domain NiRAN, yang meluas hingga RdRp.Konservasi residu utama di situs aktif nsp12 NiRAN dan target nsp9, dikombinasikan dengan data yang diperoleh dari dua virus corona termasuk SARS-CoV-2, memberikan bukti kuat bahwa nsp9 NMPylation adalah virus corona. Fitur konservatif juga merupakan langkah penting dalam replikasi virus.Data yang tersedia membawa kita pada kesimpulan bahwa peran spesifik bentuk NMPylated dari nsp9 dalam sintesis RNA yang diinduksi protein adalah skenario yang masuk akal untuk virus corona dan virus bersarang lainnya, dan NiRAN juga dapat menargetkan protein lain yang tidak teridentifikasi.Mengatur virus.Interaksi tuan rumah.Jika dikonfirmasi, keterlibatan primer protein dalam sintesis RNA virus akan meningkatkan afinitas urutan domain Mpro/3CLpro dan RdRp antara virus corona yang terdeteksi sebelumnya dan supergrup mirip picornavirus (9), yang kini telah disatukan dalam Pisonivirites yang baru dibentuk ( 46) dalam kategori.
Data kami juga menunjukkan bahwa aktivitas enzim dasar, selektif dan konservatif yang diidentifikasi dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai target obat antivirus.Senyawa yang mengganggu pengikatan (dan modifikasi selanjutnya) dari nsp9 N-terminus yang dilestarikan di situs aktif NiRAN dapat dikembangkan menjadi obat antivirus yang efektif dan serbaguna, cocok untuk pengobatan virus corona hewan dan manusia dari (sub)genus yang berbeda. , termasuk SARS-CoV-2 dan Virus Corona Sindrom Pernafasan Timur Tengah.
Urutan pengkodean protein virus corona yang dihasilkan dalam penelitian ini diamplifikasi dengan RT-PCR menggunakan RNA yang diisolasi dari Huh-7 yang terinfeksi HCoV-229E atau Vero E6 yang terinfeksi SARS-CoV-2, dan disisipkan menggunakan prosedur kloning standar.vektor ekspresi pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) atau pASK3-Ub-CHis6 (47) (Lampiran SI, Tabel S1 dan S2).Substitusi kodon tunggal diperkenalkan oleh mutagenesis terarah situs berbasis PCR (48).Untuk menghasilkan protein fusi MBP, sel E. coli TB1 ditransformasikan dengan konstruksi plasmid pMAL-c2 yang sesuai (lampiran SI, Tabel S1).Protein fusi dimurnikan dengan kromatografi afinitas amilosa dan dibelah dengan faktor Xa.Selanjutnya, protein bertanda His6 terminal-C dimurnikan dengan kromatografi afinitas logam amobil Ni (Ni-IMAC) seperti dijelaskan sebelumnya (49).Untuk menghasilkan protein fusi ubiquitin, sel E. coli TB1 menggunakan konstruksi plasmid pASK3-Ub-CHis6 yang sesuai (Lampiran SI, Tabel S1 dan S2) dan DNA plasmid pCGI yang mengkode hidrolase C-terminal 1 spesifik ubiquitin (Ubp1) di mana-mana.Transformasi (47).Protein virus corona bertanda His6 terminal-C telah dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya (50).
Tes NMPylation mandiri HCoV-229E nsp12-His6 dilakukan seperti yang dijelaskan dalam EAV nsp9 (16).Singkatnya, nsp12-His6 (0,5 µM) mengandung 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, inkubasi NTP yang ditentukan dan 0,17 µM cocok dengan [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) pada 30 °C selama 30 menit.Dalam semua pengujian NMPylation (standar) lainnya dari nsp9 NMPylation yang dimediasi nsp12, kondisi reaksi disesuaikan sebagai berikut: nsp12-His6 (0,05 µM) dan nsp9-His6 (4 µM) dengan adanya 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM mengindikasikan NTP, dan 0,17 µM cocok dengan [α32-P]NTP.Setelah diinkubasi selama 10 menit pada suhu 30°C, sampel reaksi dicampur dengan buffer sampel SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometana HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% gliserol dan 0,005% bromofenol biru.Protein didenaturasi dengan pemanasan pada suhu 90 °C selama 5 menit dan dipisahkan dengan SDS-PAGE 12%.Gel difiksasi dan diwarnai dengan larutan Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% asam asetat, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dihilangkan warnanya, dan dipaparkan pada layar pencitraan berpendar selama 20 jam (untuk mendeteksi nsp12 dari NMPylation) atau (maksimum) 2 Jam (untuk menilai nsp9 NMPylation).Imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) digunakan untuk memindai layar dan ImageJ digunakan untuk menganalisis intensitas sinyal.
Untuk analisis MS, 1 µM nsp12-His6 dan 10 µM nsp9 (tanpa tag hexahistidine) digunakan dalam analisis NMPylation (lampiran SI, Tabel S1) dan peningkatan konsentrasi 500 µM UTP dan GTP digunakan.Bergantung pada konsentrasi dan kualitas protein yang diharapkan, sistem HPLC Kelas H Waters ACQUITY yang dilengkapi dengan kolom MassPrep (Waters) digunakan untuk menghilangkan garam 1 hingga 10 µL larutan protein buffer secara online.Protein yang dihilangkan garamnya dielusi ke dalam sumber ion elektrospray spektrometer massa Synapt G2Si (Waters) melalui gradien buffer A (air/0,05% asam format) dan buffer B (asetonitril/0,045% asam format) berikut, dan suhu kolom adalah 60 ° C dan laju aliran 0,1 mL/menit: elusi secara isokratis dengan 5% A selama 2 menit, kemudian gradien linier menjadi 95% B dalam waktu 8 menit, dan pertahankan 95% B selama 4 menit lagi.
Ion positif dengan kisaran massa 500 hingga 5000 m/z terdeteksi.Glu-fibrinopeptida B diukur setiap 45 detik untuk koreksi penyimpangan massa otomatis.Gunakan perangkat lunak instrumen MassLynx dengan ekstensi MaxEnt1 untuk mendekonvolusi spektrum rata-rata setelah dikurangi garis dasar dan pemulusan.
HCoV-229E nsp9 UMPylated dicerna dengan menambahkan trypsin (Serva) termodifikasi tingkat sekuensing dan diinkubasi semalaman pada suhu 37 ° C.Kolom putar Chromabond C18WP (nomor komponen 730522; Macherey-Nagel) digunakan untuk menghilangkan garam dan memekatkan peptida.Terakhir, peptida dilarutkan dalam 25 μL air yang mengandung 5% asetonitril dan 0,1% asam format.
Sampel dianalisis oleh MS menggunakan spektrometer massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Sistem HPLC nanoâ terbaik (Dionex), dilengkapi dengan custom end-mount 50 cm??Kolom C18 RP 75 μm dikemas dengan manik magnetik 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Hubungkan ke spektrometer massa online melalui sumber nanospray Proxeon;menyuntikkan 6 µL larutan pencernaan trypsin ke dalam diameter dalam 300 µm ×??1 cm kolom prakonsentrasi PepMap C18 (Thermo Scientific).Menggunakan air/asam format 0,05% sebagai pelarut, sampel secara otomatis terperangkap dan desalinasi pada laju aliran 6 µL/menit.
Gradien air/asam format 0,05% (pelarut A) dan 80% asetonitril/asam format 0,045% (pelarut B) berikut digunakan untuk mencapai pemisahan peptida triptik pada laju aliran 300 nL/menit: 4% B untuk 5 menit, kemudian gradien linier 30 A hingga 45% B dalam beberapa menit, dan peningkatan linier hingga 95% pelarut B dalam waktu 5 menit.Hubungkan kolom kromatografi ke nano-emitor baja tahan karat (Proxeon), dan semprotkan eluen langsung ke kapiler spektrometer massa yang dipanaskan menggunakan potensi 2.300 V. Pemindaian survei dengan resolusi 60.000 di penganalisis massa Orbitrap dikaitkan dengan setidaknya tiga data pemindaian MS/MS, dikecualikan secara dinamis selama 30 detik, menggunakan disosiasi yang diinduksi tabrakan perangkap ion linier atau disosiasi tabrakan energi yang lebih tinggi dikombinasikan dengan deteksi orbitrap, Resolusinya adalah 7.500.
Waktu posting: 03 Agustus-2021